Application de la loi de Beer-Lambert

Deux cas sont possibles :
(1)-La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans le visible (subtance colorée) ou dans l'UV; on fait alors un dosage direct.
(2)-La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption caractéristique; il faut alors effectuer une réaction colorée; on fait alors un dosage indirect.

Les conditions d'une bonne méthode de dosage sont les suivantes :

-spécificité : la réaction colorée doit être spécifique de la substance à doser (qui doit être seule à réagir avec les réactifs de coloration)
-solubilité : le produit coloré obtenu doit être soluble; la solution doit être limpide pour permettre une lecture en spectrophotométrie d'absorption.
-stabilité : la coloration doit être stable pendant un certain temps, pour permettre d'effectuer les lectures sans que la coloration n'évolue; généralement il faut une certaine durée de développement de la coloration pour qu'elle soit stable.
-proportionnalité : l'intensité de la coloration obtenue (son absorbance) doit être proportionnelle à la quantité de substance à doser présente; cela nécessite de mettre les réactifs de coloration en excès (pour que la réaction colorée soit totale), et éventuellement de diluer la solution à doser (pour être dans les conditions de validité de la loi de Beer-Lambert).
-sensibilité : la réaction colorée doit être sensible, pour permettre de doser des solutions de faibles concentrations .

Méthode directe

elle consiste à mesurer A et à calculer c .
• elle nécessite de connaître le de la substance à doser à la longueur d'onde choisie, et de bien caler le monochromateur, car varie avec .

 Méthodes indirectes : elles ne nécessitent pas de connaître

a) Méthode par comparaison avec un étalon unique

elle consiste à mesurer dans les mêmes conditions l'absorbance A_d de la solution à doser et l'absorbance A_et d'une solution "étalon" ou "standard"de concentration connue c_et, puis à calculer la concentration de la solution à doser c_d.
- elle suppose mais ne vérifie pas la linéarité.

b) Méthode avec une gamme d'étalonnage

elle consiste à préparer une gamme de dilutions d'une solution étalon "mère", à mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons "filles", puis à tracer la courbe d'étalonnage A = f(c). L'absorbance de la solution à doser est mesurée dans les mêmes conditions, puis reportée sur la courbe d'étalonnage; on fait ainsi une détermination graphique de la concentration de la solution à doser (la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser) ;
- elle permet de vérifier la linéarité, et tient compte des éventuelles erreurs de manipulation (tracé d'une droite statistique).

Le point isobestique

En spectroscopie, un point isobestique est une longueur d'onde (λ), un nombre d'onde ou une fréquence spécifique à laquelle l'absorbance totale d'un échantillon reste constante durant une réaction chimique ou un changement d'état de cet échantillon. En ce point, toutes les espèces chimiques (ou tous les états) possèdent la même absorbance molaire (ε) . Ce point représente une coordonnée (λ,ε) sur un diagramme isobestique pour laquelle le spectre d'absorption de deux espèces se croisent, cette dernière affirmation n'étant vérifiée que si les absorptions molaires sont représentées (au lieu des absorbances). En d'autres termes, le point isobestique est une longueur d'onde pour laquelle ces substances ont le même coefficient d'extinction.

Les points isobestiques sont aussi utilisés en biochimie clinique, comme méthode d'assurance qualité, afin de vérifier la précision sur une longueur d'onde d'un spectrophotomètre. Cela est réalisé en mesurant le spectre d'une substance étalon pour deux conditions pH différentes (en dessus et au-dessous du pKa du composé). Les substances utilisées comme standard comprennent le dichromate de potassium (points isobestiques à 339 et 445 nm), le bleu de bromothymol (325 et 498 nm) et le rouge congo (541 nm). La longueur d'onde déterminée pour un point isobestique ne dépend pas de la concentration du composé utilisé et, en tant que tel, il devient ainsi une référence très fiable.