L'analyse spectrophotométrique est fondée sur l'étude du changement d'absorption de la lumière par un milieu, en fonction de la variation de la concentration d'un constituant. On détermine la concentration d'une substance en mesurant l'absorption relative de la lumière par rapport à celle d'une substance de concentration connue.

En analyse spectrophotométrique, on utilise une lumière sensiblement monochromatique. Ces méthodes d'analyse sont intéressantes car elles permettent de travailler sur de faibles quantités de substances et sont non destructrices vis-à-vis de l'échantillon. Elles s'appliquent à un très grand nombre de dosages.

La colorimétrie est un cas particulier de la spectrophotométrie dans le domaine du visible. On utilise une source de lumière blanche et les déterminations sont faites à l'aide d'un instrument simple appelé colorimètre. Une cellule photoélectrique permet d'apprécier l'intensité de la coloration. On utilise une lumière dont les longueurs d'ondes se situent dans un domaine spectral relativement étroit grâce à des filtres qui ne transmettent que des longueurs d'ondes d'une petite région du spectre. 

La source lumineuse

Elle est constituée par :

- Une lampe à décharge au deutérium utilisée dans le domaine de 190 à 400 nm avec un maximum d'émission à 652,1nm.

- Une lampe à filament de tungstène pour la région allant de 350 à 800 nm.

- Une lampe à décharge au xénon utilisée dans le domaine UV et visible. Ce type de lampe est très énergétique. Elle fonctionne sous forme de flash, juste au moment de faire une mesure.

 monochromateur

L'élément de base est un prisme, un réseau ou un filtre coloré. Le rôle du monochromateur est d'isoler le rayonnement sur lequel on fait la mesure. Il est composé principalement d'un système dispersif, d'une fente d'entrée et d'une fente de sortie.

cuve

Elle contient soit l'échantillon soit la référence. La longueur de la cuve est définie (1, 2, 4 ou 5cm de trajet optique). Elle doit être transparente aux radiations d'étude. Par exemple en UV, les cuves sont en quartz, elles ne peuvent être ni en verre ni en plastique.

détecteur

- photodiode (semi-conducteur)

Lorsqu'un photon rencontre un semi-conducteur, il peut transférer un électron de la bande de valence (niveau énergétique bas) vers la bande de conduction (niveau énergétique haut) en créant une paire électron - trou. Le nombre de paires électrons - trous est fonction de la quantité de lumière reçue par le semi-conducteur qui peut donc être utilisé en tant que détecteur optique.

- barrette de diodes

L'emploi d'une barrette de diodes permet une mesure simultanée sur toute l'étendue du spectre. Une barrette CCD est un alignement de photodiodes de petites dimensions (14µm x 14 µm) qui fonctionnent en intégrateur de lumière. La charge qui apparaît dans une photodiode est proportionnelle à l'exposition, c'est à dire au produit de l'éclairement par le temps de pose et elle dépend de la longueur d'onde. A la fin de la pose, le contenu des capteurs est transféré dans un registre analogique à décalage et une nouvelle pose commence. Ce registre transmet les données mémorisées en mode série, c'est à dire l'une après l'autre à un rythme fixé par l'électronique de commande de la barrette CCD. Ces données apparaissent sous forme de tension. Dans le spectrophotomètre Mécacel, ces tensions sont converties en un tableau de nombres par l'interface qui relie le spectrophotomètre à l'ordinateur. Le logiciel traite ce tableau de valeurs.

Couplé à un ordinateur, le spectrophotomètre permet de tracer très rapidement des spectres d'absorption. Le logiciel gère le temps de pose du capteur CCD.

- photomultiplicateur

Une radiation incidente arrache un électron de la cathode par effet photoélectrique. Cet électron est alors accéléré vers une seconde électrode appelée dynode portée à un potentiel supérieur. L'énergie de l'électron incident est suffisante pour arracher plusieurs autres électrons et ainsi de suite, d'où l'effet multiplicatif. Pour un électron arraché sur la cathode on peut récupérer jusqu'à 10⁶ électrons sur l'anode.