cours sur le chapitre 3
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| Cours: | CHIM 4212 :Méthode d'analyses chimiques |
| Livre: | cours sur le chapitre 3 |
| Imprimé par: | Visiteur anonyme |
| Date: | jeudi 1 mai 2025, 14:28 |
Table des matières
- 1 Les grandeurs de rétention
- 1.1 Définitions des différentes grandeurs de rétention
- 1.2 Définitions des différentes grandeurs de rétention
- 1.3 Les autres grandeurs
- 1.4 Dosage par la méthode de normalisation interne
- 1.5 Chromatographie de partage
- 1.6 THÉORIE DE LA CHROMATOGRAPHIE
- 1.7 PARAMÈTRES CARACTÉRISANT LA RÉTENTION.
- 1.8 Le facteur de rétention
- 1.9 Influence de la température sur les temps de rétention réduits tr'
- 1.10 EXERCICES D'APPLICATION
1 Les grandeurs de rétention
Définitions des différentes grandeurs de rétention
Temps de rétention
Temps mort
Temps de rétention réduit
Volume de rétention
Temps de rétention réduit
Volume de rétention réduit
Facteur de rétention k
Les autres grandeurs
1.1 Définitions des différentes grandeurs de rétention
Les grandeurs de rétention
Définitions des différentes grandeurs de rétention
Temps de rétention
C’est le temps que met le soluté à sortir de la colonne c’est à dire le temps écoulé entre l’injection et le maximum du pic du composé élué. C'est la principale grandeur de rétention.
Il est noté tR (en minutes)
Il varie en fonction du débit, de la température d'élution, de la composition de la phase mobile et du vieillissement de la colonne.
Temps mort
Il est noté tM ou t0 (en minutes)
C'est le temps que met un soluté non retenu (l’air par exemple dans le cas de la CPG) à sortir de la colonne. En HPLC, c'est également le temps mis par la phase mobile (l'éluant) pour traverser la colonne. Pour les colonnes de type C18, il est usuel d'utiliser de l'uracil, composé qui n'est pas retenu par la phase stationnaire.
Il est noté tM
Temps de rétention réduit
On ne prend plus comme origine l’injection mais le pic du temps mort.
Il est noté t'R et est égal à t'R = tR-tM
Volume de rétention
Au temps de rétention tR d’un soluté correspond un volume de rétention VR qui correspond au volume de phase mobile nécessaire à l’élution.
VR = tR x D
Avec D le débit du gaz vecteur
Temps de rétention réduit
On ne prend plus comme origine l’injection mais le pic du temps mort.
Il est noté t'R et est égal à t'R = tR - tM
Il correspond au temps de séjour du composé en contact avec la phase stationnaire.
Volume de rétention réduit
Comme pour le temps mort réduit, on définit le volume mort
Il est noté V'R et est égal à t'R = VR - VM
1.2 Définitions des différentes grandeurs de rétention
Facteur de rétention k
Le facteur de rétention caractérise la rétention d'un composé. C'est un paramètre important indépendant du débit (Attention à ne pas confondre avec le coefficient de distribution K!). Si pour 2 analyses identiques (même composé, même phase mobile):
- on a 2 valeurs de tR identiques et 2 valeurs de k différentes, cela signifie qu'il y a une fuite de phase mobile avant la colonne
- 2 valeurs de tR et de k différentes indiquent des problèmes au niveau de la phase mobile ou de la phase stationnaire
Le facteur de rétention est définit suivant la relation :
k = (tR-tM) / tM
1.3 Les autres grandeurs
Coefficient de distribution K
K = Cs/Cm
Avec Cs la concentration du soluté dans la phases stationnaire
Avec Cm la concentration du soluté dans la phase mobile
Facteur de séparation ou de rétention
Il définit la position relative de 2 pics, le pic du soluté a sortant avant le pic du soluté b:
Il est égal à a(alpha) = t'R(a)/t'R(b)
Facteur de résolution
Il définit la plus ou moins bonne séparation de deux solutés :
R = 2(tR(a)-tR(b)) / (ωa+ ωb)
Pour des valeurs de R supérieures à 1,5, les pics sont correctement séparés.
Dosage par chromatographie
Principe du dosage
La surface du pic est proportionnelle à la quantité de produit élué. Cela se traduit par la relation :
mi = KiAi
Avec
- mi : la masse du composé i injectée
- Ai l’aire du pic du composé i
- Ki le coefficient de proportionnalité
Si la masse de soluté injecté est connu, la méthode de la normalisation externe peut-être utilisée.
Si l'on ne connait pas avec précision le volume injecté, il faut faire appel à différentes méthodes de dosage :
- méthode des ajouts dosés
- normalisation interne
- l'étalon interne.
Dosage par la méthode des ajouts dosés
Principe de la méthode des ajouts dosés
Soit un mélange de 3 composés ayant des masses respectives m1, m2, m3.
Le dosage consiste à ajouter une masse m0 du composé à doser au mélange.
Pour chacun des composés l'on a : xi = mi/∑ mi = KiAi / ∑ KiAi
Exemple : on cherche à déterminer la fraction massique x2 du mélange.
Soit :
- m0 : la masse de produit 2 ajouté au mélange
- A1 et A2: les aires respectives des composés 1 et 2 avant l’ajout de m0
- A’1 et A’2 : les aires respectives des composés 1 et 2 après l’ajout de m0
- m : la masse totale m = ∑mi
x2 = K2A2 / ∑ KiAi et x’2 = K2A’2 / ∑ KiA’i
d’où : x2 = x’2.A2/A’2 x ∑ KiA’i / ∑ KiAi
pour déterminer ∑ KiA’i et ∑KiAi , on utilise un autre constituant (ici le 1)
∑ KiAi = K1A1/x1 et ∑ KiA’i = K1A’1/x’1
On en déduit x2 = A2A’1/A’2A1.x1/x’1.x’2
Il reste à éliminer x1 et x’1
x2 = m2/m
x’2 = (m2 +m0)/(m+m0)
x1 = m1/m
x’1= m1/(m+m0)
on en déduit que
x2 = (A2.A’1)/(A’2A1-A2A’1).m0/m
L'inconvénient de la méthode des ajouts dosés réside dans le fait qu'il faut disposer du produit pur pour effectuer l'ajout.
1.4 Dosage par la méthode de normalisation interne
Méthode par normalisation interne
La méthode est proche de l’étalon interne. Ici au lieu de rajouter un étalon on choisit comme étalon interne un des composés du mélange que l’on dose. Le raisonnement est identique à l’étalon interne.
xi = m’i/∑ m’i = Ki/jA’i / ∑Ki/jA’i
Autre méthode de dosage par référence interne
On réalise une droite d’étalonnage en réalisant des solutions de concentration différentes en élément à doser et en ajoutant au mélange un volume constant d’étalon.
Dosage par étalonnage interne Méthode de l’étalonnage interne
Le principe consiste à comparer les surfaces des pics du mélange avec un étalon pris comme référence. On réalise 2 chromatogrammes : le 1er pour déterminer les coefficients de proportionnalité, le 2nd pour le dosage.
On réalise le 1er mélange avec des concentrations connues en élément à doser auquel on rajoute l’étalon (e).
On a :
- me = KeAe
- m1 = K1A1
- m2 = K2A2
m1/me = K1/Ke . A1/Ae m1/me = K1/e. A1/Ae
Tout étant connu, on peut déterminer K1/e = K1/Ke qui est le coefficient de proportionnalité relatif de 1 par rapport à "e".
Pour le dosage, on ajoute un volume connue d’étalon au mélange à analyser. Le chromatogramme obtenu permet d’en déduire les fractions massiques du mélange.
m’i/m’e = Ki/e A’i/A’e
Le choix de l’étalon est essentiel :
- il doit être bien séparé des autres constituants du mélange
- son temps de rétention et sa concentration doivent être proches des éléments dosés
- il ne doit pas réagir avec les constituants du mélange
Dosage par étalonnage externe
Méthode de l’étalonnage externe
On injecte successivement un même volume d’une solution étalon (concentration en élément à doser connue Cref) et la solution à doser (concentration inconnue Ci). On compare ensuite les chromatogrammes pour en déduire la concentration.
On a mref= K. Aref et mi = KAi mref/mi = Aref/Ai
En remplaçant la masse par la concentration massique :
CrefVref/CiVi = Aref/Ai
Les volumes étant égaux, on obtient Ci = Cref.Ai/Aref
Inconvénient de la méthode de l'étalonnage externe : il faut être sûr d’injecter le même volume.
1.5 Chromatographie de partage
chromatographie liquide-liquide
La chromatographie de partage est la méthode la plus employée actuellement en HPLC.
Principe de la chromatographie de partage
La phase stationnaire et la phase mobile sont liquides.
Elle est basée sur la différence de solubilité du soluté dans la phase mobile et la phase stationnaire. Le soluté se distribue selon le coefficient de partage K = Cs/Cm avec Cs la concentration du soluté dans la phase stationnaire et Cm la concentration du soluté dans la phase mobile
Pour séparer 2 constituants, il faut qu’ils aient des coefficients de partage différents.
Dans les colonnes actuelles, la phase mobile est un liquide « fixé » par liaison covalente sur un support. Ce sont les colonnes greffées.
Chromatographie en phase normale
Les groupements silanols du gel de silice sont greffés par des molécules organiques (liaisons covalentes). Ici les molécules organiques sont polaires. Les greffons sont possibles grâce à la grande réactivité des groupements silanols.
On procède soit à une estérification :
SiOH + ROH SiOR + H2O
Soit à une silanisation
Les principales greffes polaires sont :
-
alkylnitrile : – (CH2)n - CN
-
aminopropyle : – (CH2)3 – NH2
Le solvant est peu polaire
Chromatographie de partage à polarité de phase inversée
La phase stationnaire est apolaire et le solvant polaire. Ce sont des gels de silices comportant des greffons alkyles. Les plus utilisées sont les greffons à 8 et 18 atomes de carbone (colonnes C8 et C18).
La chromatographie d’échange d’ion (HPLC)
Elle consiste à un échange réversible d’ions entre la phase mobile et la phase stationnaire. Cette dernière est porteuse de groupements ionisés fixes et d’ions mobiles assurant l’électroneutralité. Ce type de chromatographie s’adresse au produits ioniques ou ionisables.
Exemples de phases stationnaires en chromatographie d'échange d'ions.
---- fortement acide : -SO3- H+
---- faiblement acide : -COO-H+
---- fortement basique : -CH2-N+(CH3)3 Cl-
---- faiblement basique –N+H(R2)Cl-
La résine doit être préparée suivant la séparation à effectuer et régénérée en fin d’élution.
La chromatographie d’exclusion (ou perméation de gel)
Principe de la chromatographie d'exclusion
Les molécules sont plus ou moins retenues suivant leur taille et leur possibilité de pénétrer dans les pores de la résine. Les grosses molécules qui ne peuvent pas rentrer dans les pores ne sont pas retenues. Les solutés sont élués dans l’ordre des masses molaires décroissantes.
1.6 THÉORIE DE LA CHROMATOGRAPHIE
COMMENT AMÉLIORER UNE SÉPARATION EN CHROMATOGRAPHIE ?
Séparations entre 2 pics en chromatographie
Il y a deux possibilités pour améliorer la séparation entre les 2 pics du chromatogramme (a) :
1- A largeur de pic constante, on peut augmenter la différence de temps de rétention entre les 2 pics, ceci est illustré dans chromatogramme (b)
2- A temps de rétention constant, on peut diminuer la largeur des pics, le chromatogramme (c) illustre ce phénomène.
En pratique, on peut jouer à la fois sur ces 2 paramètres pour améliorer une séparation.
En conclusion, deux paramètres s'avèrent donc primordiaux en chromatographie, la rétention et la forme du pic.
1.7 PARAMÈTRES CARACTÉRISANT LA RÉTENTION.
Le chromatogramme du Prozac (antidépresseur) a été enregistré dans les conditions suivantes :
HPLC. Colonne C18: 15cm x 4.6mm
Phase mobile: acetonitrile / 25mM KH2PO4 pH 7.0 (40:60)
Débit: 2mL/min. Température: 30°C
Détecteur UV : 254 nm . Injection: 1µL
Chromatogramme du Prozac
Le temps de rétention.
Le temps de rétention tr d'un produit S est le temps écoulé entre le début de l'injection et la sortie du produit. (pour le chromatogramme 2, tr = 3 mn)
tr dépend du produit S et des conditions expérimentales (colonne, température, débit de phase mobile... etc.)
Le volume de rétention
Le volume de rétention Vr correspond au volume de phase mobile nécessaire pour éluer le produit S. Si D est le débit de la phase mobile (D supposé constant) :
Vr = tr * D. (pour le chromatogramme 2, Vr = 3*2 = 6 ml)
Le temps mort.
Le temps mort tm est le temps que met la phase mobile pour traverser la colonne. (dans la figure 2, tm = 1mn)
La phase mobile est caractérisée par sa vitesse linéaire u de déplacement dans la colonne de longueur L, on a :
u = L / tm (pour le chromatogramme 2, u = 15 cm/mn)
En CPG, le temps mort correspond au temps de rétention de substances non retenue par la phase stationnaire comme l'air ou le méthane.
Le volume mort.
On appelle volume mort Vm le volume de phase mobile qui passe à travers la colonne pour aller d'une extrémité à l'autre de la colonne (pendant le temps tm). Autrement dit, Vm est le volume occupé par la phase mobile dans une colonne.
Vm = tm * D. (pour le chromatogramme 2, Vm = 1*2 = 2 ml)
Vm ne dépend que de la géométrie et du remplissage de la colonne.
Volume et temps de rétention réduits
On appelle volume de rétention réduit V'r, la différence entre les termes Vr et Vm.
V'r = Vr - Vm (pour le chromatogramme 2, V'r = 4 ml)
Le volume de rétention réduit correspondant au produit S est le volume de phase mobile qui doit passer à travers la colonne pour éluer le composé S.
De la même façon, on définit un temps de rétention réduit t'r.
t'r = tr - tm (pour le chromatogramme 2, t'r = 2 mn)
Les volumes et temps de rétention réduits sont indépendants des volumes et temps morts, elles dépendent donc moins de l'instrumentation (de la colonne).
1.8 Le facteur de rétention
Le facteur de rétention (ou de capacité).
Le facteur de rétention k' pour un produit donné est défini comme suit :
ou également
Ce qui donne : Vr = Vm(1 + k’) et tr = tm(1 + k’)
Les facteurs de rétention sont des grandeurs sans dimension donc plus générales d'un produit donné que les temps ou les volumes de rétention réduits. (pour le chromatogramme 2, k' = 2)
D'où une définition du facteur de rétention d'après (eq.1-3) : c'est le rapport du temps passé par le soluté dans la phase stationnaire sur le temps passé par ce même soluté dans la phase mobile.
INTERPRÉTATION THERMODYNAMIQUE DES PARAMÈTRES DE RÉTENTION
La constante d'équilibre (ou constante de partition) K
Le problème est le suivant: trouver les relations entre les paramètres de rétention (Vr, k', tr' et tr) et la constante d'équilibre K caractérisant l'équilibre suivant:
L'élution d'un soluté S en chromatographie est donc caractérisée par la constante d'équilibre K, appelée aussi constante de partition.
K = [Ss]/[Sm] où [Ss] = ms/Vs et [Sm] = m/Vm
avec mm = masse du soluté dissous dans la phase mobile.
ms = masse du soluté S dissous dans la phase stationnaire
Vm = volume de la phase mobile (équivalent au volume mort)
Vs = volume de la phase stationnaire
Vm et Vs sont constants pour une colonne donnée avec une phase stationnaire donnée (b (béta) = Vm/Vs).
Le paramètre b, appelé rapport de phases est une constante qui caractérise une colonne de chromatographie.
b sera calculé par la suite pour une colonne capillaire en chromatographie en phase gazeuse.
La relation devient : 
Le facteur de rétention k'
Si on suppose que Vr est proportionnel à la masse totale de soluté dissous dans la phase stationnaire et dans la phase mobile.
On a donc Vr proportionnel à (ms + mm )
De la même façon, si on suppose que Vm est proportionnel à la masse de soluté dissous dans la phase mobile.
On a donc Vm proportionnel à mm
On en déduit que 
d'où 
ce qui nous donne une relation fondamentale de la chromatographie :
Le temps de rétention tr
D'après les équations précédentes, on déduit que :
et 
La dernière expression est cohérente, si un produit n'a aucune affinité avec la phase stationnaire : [Ss] = 0 donc K = 0 et tr = tm . Ceci est le cas de l'air ou en première approximation du CH4 en CPG, ce qui permet la mesure du temps mort.
1.9 Influence de la température sur les temps de rétention réduits tr'
Influence de la température sur les temps de rétention réduits tr'
K varie avec la température T suivant l'équation classique (eq.1-9), où delta G° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases. K est >>1 donc G° est négative.
En combinant cette expression avec l'équation 1-8, on trouve la relation entre le temps de rétention réduit et la température :
Où delta G° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté entre les phases mobile et stationnaire.
Représentation graphique du terme DrG°(dissol pm → ps)
Considérons deux températures T1 et T2 où T2>T1 avec les facteurs de rétention correspondants k'1 et k'2, la formule devient:
comme t'r1>t'r2, on voit que 
H° est toujours <0.
Le temps mort tm, peut être supposé indépendant de la température pour une colonne donnée et une pression donnée.
En réalité, lorsque la température augmente, le mouvement brownien augmente, la viscosité de la phase mobile diminue et sa vitesse augmente légèrement dans la direction de la colonne. On observe expérimentalement une faible augmentation du temps mort avec la température.
1.10 EXERCICES D'APPLICATION
Exercice 1
Les paramètres thermodynamiques des produits suivants ont été mesurés sur une colonne capillaire ayant pour phase stationnaire un polysiloxane. Les termes H° et S° correspondent aux variations d'enthalpie et d'entropie de dissolution des produits entre la phase gazeuse et la phase stationnaire.
Quelle sera l'ordre d'élution de ces produits à 120°C ? Justifier votre réponse par un calcul simple.
|
|
Décane |
Butyl acétate |
1-Heptanol |
1-Bromobutane |
Hexyl acétate |
H° Kj/mol |
-47,2 |
-34 |
-36.9 |
-31 |
-42 |
S° en u.e. |
-75.4 |
-58 |
-58 |
-51 |
-66 |
Solution
On a G° = H° -TS° , plus G° est petit (grand en valeur absolue) plus le produit est retenu sur la colonne. A 120°C soit T = 393°K , on a les résultats ci-dessous :
|
|
Décane |
Butyl acétate |
1-Heptanol |
1-Bromobutane |
Hexyl acétate |
|
|
-.17,5 |
-11,2 |
-14.1 |
-10.96 |
-16,06 |
|
Ordre d'élution |
5 |
2 |
3 |
1 |
4 |
Exercice 2
Le chromatogramme de la nicotine a été obtenu dans les conditions suivantes :
CPG. Colonne remplie
Phase stationnaire: 10% Carbowax 20M/2% KOH sur 80/100 Chromosorb W AW
Dimensions de la colonne: Longueur 6' (183cm) x 2mm (diamètre intérieur)
Débit de la phase mobile: 20mL/min.
Quantité injectée:1µL
Four: 200°C. Temps de rétention de la nicotine = 3,20 mn
Four: 180°C. Temps de rétention de la nicotine = 6,60 mn
